EASYspin 組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒

EASYspin RNA Rapid Tissue and cell Kit

保存條件：本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 12 個(gè)月不影響使用效果。

產(chǎn)品介紹：

*的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞 RNA 酶，然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)

合條件后,RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，后低鹽的 RNase free H₂0 將純凈 RNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。

自備試劑：乙醇, β-巰基乙醇注意事項(xiàng)：

1.需要自備一次性注射器，研缽。RA105 EASYspin  組織 細(xì)胞RNA快速提取試劑盒-MBI2.裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

3.關(guān)于DNA 的微量殘留：

一般說(shuō)來(lái)任何總RNA 提取試劑在提取過(guò)程中無(wú)法*避免DNA 的微量殘留,本公司的EASYspin 系列RNA 提取產(chǎn)品，在大多數(shù) RT-PCR 擴(kuò)增過(guò)程中極其微量的DNA 殘留（一般電泳 EB 染色紫外燈下觀察不可見(jiàn)）影響不是很大, 如果要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA 表達(dá)量分析如熒光定量 PCR,我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：

1） 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過(guò) mRNA 中的連接區(qū),這樣 DNA 就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。

2） 選擇基因組DNA 和 cDNA 上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。

操作步驟：

提示：

次使用前請(qǐng)先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入量無(wú)水乙醇! 操作前在裂解液RLT 中加入β-巰基乙醇至終濃度 1%，如 1 ml RLT  中加入 10μl β-巰基乙醇。此裂解液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RLT 4℃可放置一個(gè)月。

1. 組織培養(yǎng)細(xì)胞

a. 收集<107 懸浮細(xì)胞到一個(gè) 1.5ml 離心管，對(duì)于貼壁細(xì)胞，孔板培養(yǎng)可以直接裂解， 細(xì)胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來(lái)收集。

b. 2,000rpm 離心 10 sec（或者 300g 離心 5 min），使細(xì)胞沉淀下來(lái)。*吸棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)，注意不*棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。

c. 輕彈管壁將細(xì)胞沉淀*松散重懸， 加入 350μl（<5x106 細(xì)胞） 或者 600μl（5x106-1x107 細(xì)胞）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩 20 sec，充分裂解。

d. 用帶鈍針頭的一次性 1ml(配 0.9mm 針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿(mǎn)意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿 30 sec),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

e. 接操作步驟項(xiàng)下 3。

2. 動(dòng)物組織（例如鼠肝腦）

a. 電動(dòng)勻漿： 新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊, 加入 350μl(<20mg 組織) 或者600μl(20-30mg 組織)的裂解液RLT 后電動(dòng)*勻漿 20-40 sec。

b. 液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，取適量組織細(xì)粉(20mg/30mg)轉(zhuǎn)入 裝有 350μl/600μl 組織裂解液 RLT 的 1.5ml 離心管中,  用手劇烈振蕩 20 sec，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配 0.9mm 針頭)  注射器抽打裂解物 10  次或直到得到滿(mǎn)意勻漿結(jié)果(或者電動(dòng)勻漿30 sec),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

c. 將勻漿后裂解物 12,000rpm 離心3 min,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物,將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個(gè)新離心管。

d. 接操作步驟項(xiàng)下 3。

3. 較估計(jì)裂解物(上清)體積,加入等體積的 70%乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!）,此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過(guò)程,立即吹打混勻,不要離心。

4. 立刻將混合物(每次小于 700μl,多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱 RA 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 離心 60 sec，棄掉廢液。

5. 加 350μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 30 sec，12,000rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。

6. DNaseI 工作液的配制：取 10μl DNaseI 儲(chǔ)存液放入新的 RNase-free 離心管中，加入70μl RDD 溶液，輕柔混勻。

7. 向吸附柱 RA 中央加入 80μl DNaseI 工作液，室溫放置 15 min（一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果，如果室溫效果不佳可選擇在 37℃放置 15 min）。

8. 加 350μl 去蛋白液 RW1，室溫放置 30 sec，12，000rpm 離心 30 sec，棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。

9. 加入 500μl 漂洗液 RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm  離心 30 sec，棄掉廢液。加入 500μl 漂洗液 RW,重復(fù)一遍。

10. 將吸附柱 RA 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以*晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11. 取出吸附柱 RA，放入一個(gè) RNase free 離心管中，根據(jù)預(yù)期 RNA 產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free wate（r  事先在65℃水浴中加熱效果更好），室溫放置1 min，

12,000rpm 離心 1 min。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）次高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

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