游離脂肪酸(FFA)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

FFA 既是脂肪水解的產(chǎn)物,又是脂肪合成的底物。血清中 FFA 的濃度與脂類(lèi)代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能有關(guān)。

測(cè)定原理：

FFA 與銅離子結(jié)合形成脂肪酸銅鹽，并溶于lv仿；利用銅試劑法測(cè)定銅離子含量，即可推算出游離脂肪酸含量。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、一個(gè) 25 mL 玻璃瓶、兩個(gè) 10 mL 玻璃瓶、正庚烷、無(wú)水甲醇、lv仿（三氯甲烷）、無(wú)水乙醇和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，室溫保存。

試劑二：自備。實(shí)驗(yàn)前1 d，加入9.6 mL正庚烷，0.4 mL無(wú)水甲醇，10 mL lv仿（自備）， 蓋緊后混勻，室溫保存。

試劑三：液體×1 瓶，室溫保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前在試劑瓶中加入4 mL無(wú)水乙醇，充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶，室溫保存。臨用前加入7.8 mL LV仿充分溶解，即為500µmol/L 的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品中 FFA提取：

1、血液中 FFA 測(cè)定：將所取血液，室溫靜置 1 h 后，于 4 ℃ 離心機(jī) 3 500 rpm 離心 15min， 取上層血清置于-20℃冰箱保存，待測(cè)。

2、組織中 FFA 含量測(cè)定：組織用生理鹽水沖洗干凈后，用吸水紙吸取表面水分，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，入 1mL 試劑一） 進(jìn)行冰浴勻漿，8000rpm，4℃離心 10min，取上清液，待測(cè)。

3、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體（mL）為500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一）冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 2 秒，間隔 3秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000rpm，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定：

• 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。
• 空白管：取0.5mL EP管，加入 2µL 蒸餾水，100µL 試劑二，40µL 試劑三，

蓋緊后充分震蕩混勻（2min），靜置5 min，取上層清液50µL于0.5mLEP管，加入100µL 試劑二，40µL 試劑四，混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板，靜置 15min，于 550nm 光吸收，記為 A 空白管。

• 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP管，加入 2µL 標(biāo)準(zhǔn)液，100µL 試劑二，40µL 試劑三，

蓋緊后充分震蕩混勻（2min），靜置5 min，取上層清液50µL于0.5mLEP管，加入100µL 試

劑二，40µL 試劑四，混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板，靜置 15min，于 550nm 光吸收，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

• 測(cè)定管：取 0.5mL EP 管，加入2µL上清液，100µL 試劑二，40µL 試劑三，

蓋緊后充分震蕩混勻（2min），靜置5 min，取上層清液50µL于0.5mLEP管，加入100µL 試劑二，40µL 試劑四，混勻后倒入微量石英比色皿/96 孔板，靜置 15min，于 550nm 光吸收，記為 A 測(cè)定管。

FFA 含量計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 血液中 FFA 含量計(jì)算

FFA（µ mol/L）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×1 L

=500×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L；1 L：指每升樣品。

2. 組織中 FFA 含量計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA（µ mol/mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ÷Cpr

=0.5×(A測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

FFA（µ mol/g mass）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷W

=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

FFA（µ mol/104cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 樣總

÷細(xì)胞數(shù)量=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L；1 L：指每升樣品；V 樣總：上清液總體積，1 mL=0.001L；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 血液中 FFA 含量計(jì)算

FFA（µ mol/L）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×1 L

=500×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L；1 L：指每升樣品。

2. 組織中 FFA 含量計(jì)算

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA（µ mol/mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷Cpr

=0.5×(A測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

FFA（µ mol/g mass）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V樣總÷W

=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

FFA（µ mol/104cell）=[C 標(biāo)準(zhǔn)液×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V 樣總÷細(xì)胞數(shù)量=0.5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)液：500µmol/L；1 L：指每升樣品；V 樣總：上清液總體積，1 mL=0.001L；Cpr：樣

本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑四配制應(yīng)盡量晚配，在操作到加入試劑三時(shí)，再配制試劑四。

2. 該試劑盒不可用塑料比色皿和 96 孔板測(cè)定，需用玻璃比色皿。

總抗氧化能力試劑盒說(shuō)明書(shū)（可見(jiàn)分光光度法）