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細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書

Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit 

目錄號：K2575   

保存：  -20℃避光保存 

組分說明

Cat.No.                 K2575

KitSize                 50

DyeingBuffer             22.5ml

25×PropidiumIodide，PI     750 μl 

產品簡介 

    細胞周期與凋亡檢測試劑盒是一種采用經典的碘化丙啶染色(Propidiumstaining，即 PIstaining)方法進行細胞周期與細胞凋亡分析的檢測試劑盒。

碘化丙啶(Propidium，簡稱PI)是一種雙鏈DNA 的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈 DNA 結合后可以產生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA 的含量成正比。細胞內的 DNA 被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA 含量測定，然后根據DNA 含量的分布情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。碘化丙啶染色后，假設G0/G1 期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA 的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA 復制的S期細胞的熒光強度為1-2 之間。凋亡細胞由于細胞核發生濃縮以及發生DNA*片段化(DNAfragmentation)導致部分基因組 DNA*片斷在染色過程中丟失，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現明顯的弱染，即熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現所謂的sub-G1 峰，即凋亡細胞峰。細胞發生凋亡時，由于胞漿和染色質濃縮、核碎裂，產生凋亡小體，使細胞的光散射性質發生變化。在細胞凋亡的早期，細胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側向光散射的能力增加或沒有變化。在細胞凋亡的晚期，前向和側向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況。

    本試劑盒通常應用于培養的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測。如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細胞狀態，才可以進行檢測。

    本試劑盒每個樣品的細胞數量可以為10-100 萬。

注意事項 

1.  本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。

2.  需自備PBS、95%乙醇和RNaseA。

3.  熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

4.  PI 對人體有刺激性，請注意適當防護。

5.  請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 細胞樣品的準備：

a. 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1毫升冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

b. 對于懸浮細胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50 微升左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到1.5 毫升離心管內。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

2. 細胞固定：

  取4 毫升冰浴預冷的95%乙醇，低速渦旋震蕩的同時加入 1 毫升細胞懸液，混勻后 4℃固定 2 小時或更長時間。固定12-24 小時可能效果更佳。1000×g 左右離心 3-5 分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的乙醇，以避免吸走細胞。加入約 5ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈擊離心管底以適當分散細胞，避免細胞成團。

3.PI 染色液的配制：

    參考下表，根據待檢測樣品的數量配制適量的PI 染色液：

         

                     1 個樣品      6 個樣品     12 個樣品 

DyeingBuffer           0.4ml        2.4ml      4.8ml 

25×PropidiumIodide，PI    15μl         90μl     180μl 

RNaseA(10mg/ml，自備)     1μl       6μl      12μl 

注：配制好的PI 染色液短時間內可以4℃保存，宜當日使用。

4. 染色：

    每管細胞樣品中加入400μlPI 染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴 30 分鐘。隨后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24 小時內完成流式檢測，*好能在當日完成流式檢測。

5. 流式檢測和分析：

    用流式細胞儀在激發波長488nm 波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行細胞DNA 含量分析和光散射分析。



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