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豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)

豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離液試劑盒說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A．適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B．耗材

【檢驗(yàn)方法】
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
1.首先制備骨髓單細(xì)胞懸液，制備方法詳見(jiàn)“骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。
2.取一支     15ml離心管，加入與骨髓單細(xì)胞懸液等量的分離液（注：分離液zui少不得少于
3ml）。
3.用吸管小心吸取骨髓單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-550g，離心20-30min。（注：
根據(jù)骨髓單細(xì)胞懸液量確定離心條件，骨髓單細(xì)胞懸液量越大，離心力越大，離心時(shí)間
越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
4.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色目

的細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
5.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一15ml離心管中，向離心管中加入
10ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
6.250g，離心 10min。
7.棄上清。
8.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
9.250g，離心 10min。
10.重復(fù)  7、8、9，棄上清后以 0.5ml后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
11.差異貼壁法純化細(xì)胞
（1）用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)： CSC2015TBD）或干細(xì)胞*培養(yǎng)基（產(chǎn)品
編號(hào)：HCSC2015TBD）以 1.5-3×106個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板
或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱(chēng)為單核細(xì)胞）。
（3）10-24小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注：
a)
無(wú)血清培養(yǎng)基中不含任何動(dòng)物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加10%自體血漿或
2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。
由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開(kāi)已達(dá)簡(jiǎn)單的純化目的，此法成
本相對(duì)較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽(yáng)性或陰
性分選。
【注意事項(xiàng)】
1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，zui
好在取樣2h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過(guò)6h后
分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2.本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離
心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面
會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3.吸取過(guò)多的目的細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒

細(xì)胞數(shù)量增加。
4.分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本量時(shí)，分離效果更佳。
5.如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)技術(shù)以尋求支持幫助。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
2.所獲得干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3.所獲得干細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
4.所獲得干細(xì)胞的鑒定方法。
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞分離、
純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊(cè)”，并在說(shuō)明書(shū)項(xiàng)目欄下下載使用。
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離
心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min為準(zhǔn)。